Molekyyligeneettiset tutkimusmenetelmä

Tutkia ja tunnistaa varianttien DNA-rakennetta, jota käytetään molekyyligenetiikan menetelmä. Kunkin DNA-alue, joka tutkii tällä alueella kromosomissa, geeni tai alleeli, menetelmät eroavat toisistaan. Taustalla kukin molekyyligeneettinen menetelmä käsittää joitakin tai muu manipulointi RNA: n ja DNA: ta. Kaikki nämä menetelmät ovat ominaista valtava monimutkaisuus, ilman laboratorio-olosuhteissa, ei voida toteuttaa, ja henkilökunta on erittäin pätevä. Tämä työ tehdään useassa vaiheessa.

vaiheet

Ensimmäinen, RNA: ta tai DNA-näytteitä voidaan tuottaa. Täällä, molekyyligenetiikan menetelmää voidaan soveltaa käytännöllisesti katsoen mihin tahansa materiaali: tippa verta, leukosyyttien, fibroblasteissa, kulttuuri, limakalvon (kaavittu), jopa karvatupet, - DNA: ta voidaan saada mistä tahansa näytteestä. On sopivaa käyttää molekyyligenetiikan menetelmiä ja niiden eri vaihtoehtoja ja on pitkään eristetty DNA: ta säilytettiin pakastettuna. Toinen vaihe on omistettu kertyminen haluttujen fragmenttien (vahvistus) DNA, koska se auttaa varmistamaan, polymeraasiketjureaktio in vitro (in vitro ei osallistu elävän organismin). Seurauksena, valittu DNA-fragmentti kertoo tämän ketjureaktion, ja DNA: n määrä kasvaa kirjaimellisesti miljoonia kertoja.

Kolmas vaihe molekyyligenetiikan tutkimusmenetelmiä oletetaan kerrotun DNA rajoitus (tämä pirstoutuminen, repiminen tai leikkaus). Rajoitus suoritetaan elektroforeesilla polyakryy- tai agaroosigeelillä. Tämän molekyyli- geneettinen menetelmä tutkia DNA-fragmentin avulla kaikkien ottaa tietyn aseman geelin. Sen jälkeen geeli käsitellään etidiumbromidia, joka kykenee sitoutumaan DNA: ta, säteilytys ultraviolettivalolla, niin se on mahdollista havaita luminesenssin osia. Molekyyligeneettinen diagnostiset menetelmät ovat vaihtelevia ja lukuisia, mutta kaksi ensimmäistä vaihetta ovat yhteisiä kaikille. Mutta jotta voidaan tunnistaa DNA-fragmentit, geeli voidaan värjätä, ja monia muita olemassa olevia menetelmiä.

laji

Suorin ja laajalti menetelmiä mykobakteerien havainnoimiseksi, voi sisältyä edellä mainittu molekyyligenetiikan DNA opetusmenetelmä. Sen ydin on, että jotta voidaan tunnistaa scan ketjun materiaali spesifisten DNA-fragmentteja taudinaiheuttajia. Molekyyligeneettinen diagnostiset tekniikat eivät ole vielä tehokkaampi tapa tunnistaa tällaisia tauteja kuten tuberkuloosi. Käyttäen polymeraasiketjureaktiota (PCR), voi olla varma, että alkuperäinen DNA lisätä kopioiden miljoona kertaa, eli siellä on vahvistus, ja se näyttää tulokset. Herkkyys taso on erittäin korkea - enemmän kuin yhdeksänkymmentäviisi prosenttia, mikä on tärkein etu tämän menetelmän.

Loput molekyylitason geneettisten menetelmien tutkimuksen tehokkuutta saanto useita kopioita kirjaimellisesti kaksinkertaistunut, koska tässä tapauksessa laatimiseen näyte osoittaa spesifistä oligonukleotidisekvenssiä kasvoi sata ja kuusi kertaa. Jopa kulttuuri todettu tuberkuloosi hengitysteiden merkittävästi alentaa sen herkkyyttä. Tämän vuoksi moderni lääketiede perustuu molekyyligenetiikan diagnoosi tuberkuloosista. A val- menetelmä on tehokas erityisesti silloin, kun kyse patogeenien korkean antigeenisen vaihtelevuuden, määrätä, että muuten on paljon vaikeampaa - vaatii erityistä ravintoalustalla ja viljellä pitkään. Biokemiallisia ja molekyyligenetiikan menetelmät tuottavat hyvin erilainen vaikutus tuloksiin.

todettu tuberkuloosi

Marshall PCR todettu tuberkuloosi yleisimmin käyttäen näitä DNA-sekvenssejä, jotka ovat spesifisiä kaikille neljä taudin. Tämän tavoitteen saavuttamiseksi käytetään usein alukkeita, jotka tunnistavat sekvenssin ON elementit (IS-986, IS-6110), koska nämä tekijät ovat ominaisia erittäin muuttavia lajeja Mycobacterium tuberculosis ja aina läsnä useita kopioita genomiin. Lisäksi DNA: n uutto voidaan suorittaa puhtaista viljelmistä ja kliininen (yskös potilaista) millä tahansa muulla sopivalla menetelmällä. Esimerkiksi, on puomi menetelmä, jossa lyysipuskuria käytetään perustuu guanidiinitiosyanaatti ja piidioksidia kantaja-DNA: ta. Potilaiden määrä, jotka eroavat huono bakteriologinen kasvaa joka vuosi, ja siksi kliinisessä käytännössä on perustettu aivan eri tasolle: molekyyli-geneettinen menetelmä tutkia DNA on tärkeä rooli diagnostiikassa.

Meidän on kuitenkin myönnettävä, että se ei ole ilman haittoja. PCR-menetelmällä on käyttää usein tuo valtavan määrän vääriä positiivisia tuloksia, ja syy on paitsi teknisiä virheitä, mutta myös menetelmän ominaisuuksia itse. Lisäksi käyttämällä tätä menetelmää diagnoosin määrittämiseksi elinkelpoisuuden mykobakteerien, jotka on tunnistettu, se on yksinkertaisesti mahdotonta. Mutta tämä haitta ei ole tärkeintä. Molekyyligeneettiset PCR-menetelmiä diagnostiikka vaarana saastumisen mykobakteeri-DNA: ta. Sertifiointivaatimukset Tämän vuoksi PCR laboratorioille tarkoitettu ainoastaan kovia, ne vaativat kolme eri tiloissa. PCR-tekniikka on moderni ja hyvin monimutkainen, se edellyttää asianmukaisia laitteita ja korkea koulutettu henkilökunta.

bacterioscopy

Kun diagnoosi analyysin tulokset on verrattava muihin tietoihin: kliininen tutkimus, röntgen, kokeena mikroskopia, leikkaa kuvaa ja vastauksena tiettyyn hoito ovat erittäin tärkeitä. Tässä sarjassa, PCR-tutkimukset on vain yksi komponenteista. Tunnistaa taudinaiheuttaja varhainen diagnosointi voi olla yksinkertaisin ja nopein menetelmiä - bakteriologisen.

On käytetty valomikroskoopilla (värjäämiseen Ziehl-Neelsen) ja fluoresoivat (väritys fluorokromeihin). Etuna on nopeus preparaatti tuloksia. Mutta sen haittana pidetään oikeutetusti rajallinen kapasiteetti alhaisen herkkyyden. Kuitenkin tämä menetelmä on esitetty WHO: n suosituksia edullisinta ja maan havaita tuberkuloosipotilaille. Havaitseminen mykobakteerien bakteeri- menetelmä on ennustearvon ja arvioidaan kvantitatiivisesti bakteerien erittymistä. Paljon varmempi käsitellä sitä molekyyligenetiikan tutkimusmenetelmiä tuberkuloosiin.

Cultures

Parempi havaitseminen mykobakteerien tunnistavat kulttuurintutkimuksen. Kylvö patologinen materiaalia siitä valmistetaan munan väliaine: Mordovsky, Finn II LJ ja vastaavat. Viitearvot resistenssin mykobakteerien lääkkeiden ja epäsuora todiste tehokkuutta useiden mykobakteerien ja niiden pesäkkeiden in vitro, jos käytetystä menetelmästä tutkimuksen kulttuurin. Lisätä prosenttiosuus eristäminen mykobakteerien inokulaation patologisen pidetään useita ympäristöjä.

Tarpeisiin lukuisia kulttuuritapahtumia, taudinaiheuttaja lukien avustus ja nesteet. Tässä järjestelmässä käytettyihin ja automatisoitu annostelutyyppisen VANTES kasvua. Viljelykasvien on pidettävä inkubaation jopa seitsemän ja kahdeksan viikkoa. Tähän mennessä viljelykasvien kasvun pysähtyminen voidaan pitää negatiivinen. Tehokkain tapa tunnistaa Mycobacterium tuberculosis harkita biologisia näytteitä: Diagnoositarvikkeet tartuttavat marsut, jotka ovat erittäin alttiita TB.

joitakin lukuja

Mielenkiintoinen alan tutkimus, joka avattiin PCR diagnostiikka oli tutkia M. tuberculosis - piilevä infektio. Moderni käsite TB infektio viittaa siihen, että ulos sata ihmistä, jotka olivat kosketuksissa tuberculosis yhdeksänkymmentä voi hyvinkin saada tartunnan, mutta vain kymmenen heistä on aktiivinen taudin kehitetään. Toiset ovat TB immuniteetti, ja koska yhdeksänkymmentä prosenttia tapauksista infektio on edelleen piilevä. Havaitsemaan kuvio se on auttanut molekyyli- geneettinen menetelmä.

Geneetikot sanoa, että viisikymmentäviisi prosenttia joiden viljelykasvien patologinen materiaali olivat negatiivisia, ja kahdeksankymmentä prosenttia tartunnan saaneista ihmisistä M. tuberculosis, mutta virtaa ilman röntgenlöydösten ilmenemismuodot tauti, PCR-positiivinen vastauksista. Se on geneettinen diagnostinen menetelmä auttaa tunnistamaan potilaita, joilla on riski PCR tutkimusten tulosten kanssa niiden analyysien (mikroskopia ja kulttuuri) on negatiivinen, ja piilevää tartuntaa M. tuberculosis oli läsnä.

nykyaikainen tutkimus

Venäjän federaation bakteeri- ja laboratoriot käyttävät nopeutettua menetelmää absoluuttinen pitoisuudet: nitraattireduktaasiaktiivisuuden mykobakteerien testattiin Griessin reagenssia. Anti-TB keskukset käyttävät menetelmää, jonka avulla voidaan määrittää lääkeresistenssin. Tämä kylvö nestemäisissä, jossa automatisoitu radiometriset ja fluoresoiva kirjanpito kasvua mykobakteerien. Tällainen analyysi tehdään nopeasti - jopa kaksi viikkoa.

Tällä hetkellä, uusia menetelmiä kehitetään: lääkeresistenssin mykobakteerien mitataan genotyyppi tasolla. Tutkimus molekyylitason mekanismeja resistenssigeenien ja osoittaa, että läsnä mykobakteerien. Nämä geenit liittyvät resistenssiin tietyille lääkkeille. Esimerkiksi, Kasa geenit, Inha, katG kestävät isoniatsidi, rpoB-geenin - rifampisiini 16Sp-RNA-geeneissä ja rpsL - streptomysiiniä, emb1 - etambutoliin, gyrA - Fluorokinoloneihin ja niin edelleen.

mutaatiot

Moderni diagnoosi huomattavasti molekyylitason geneettisellä tasolla tutkimuksena DNA: ta ja voivat suorittaa suuren mittakaavan tutkimuksia mutaatioiden kaikki spektrissä. Nyt me tiedämme, että yleisimmät mutaatiot 516, 526 ja 531 kodonit rpoB geeni, ja tunnistaa vastustuskykyä eri lääkkeitä. On koko joukko menetelmiä tyypitys mykobakteerien käyttää ei vain perinteisiä menetelmiä - biokemialliset, biologiset ja kulttuurin, mutta myös laajalti käytetty moderni molekyyligenetiikan tekniikoilla. Jo on riittävät ja tarjoavat oikean diagnoosin menetelmä havaitsemiseksi geeniin sairauksia. Ne perustuvat DNA tutkimuksia tarkka alueella tietyn geenin. Tämä on yleensä monimutkainen prosessi, aikaa vievää ja kallista, mutta data, joka on aikaansaatu molekyyli- geneettinen analyysi, on paljon tarkempi ja informatiivinen kuin tiedot kaikkien muiden analyysien.

Se on jo pitkään ollut tiedossa, että DNA ei muutu koko elämän organismin, että se on mikä tahansa tumallisten solujen odnakova, ja tämä tekee mahdolliseksi ottaa analyysin ehdottomasti kaikki solut kehon missä tahansa vaiheessa ontogeny. Vahingoittuneen geeni voidaan havaita ennen ulkonäköä ensimmäiset oireet täyden mittakaavan kliininen tauti, sekä terveillä heterotsygoottisessa ihmisiä, mutta joilla on mutaatio. Molekyyligeneettinen perinnöllinen sairaus diagnostisten menetelmien avulla voidaan paljastaa sen (suora lähestymistapa DNA-diagnostiikka), sekä segregaation analysoimiseksi sairauden perheen kanssa merkki loci DNA (geneettisten polymorfismien), jotka liittyvät läheisesti toisiinsa, joissa on vahingoittunut geenin (eli epäsuora lähestymistapa DNA-diagnostiikka). Suoraan tai epäsuorasti - mikä tahansa DNA-diagnostiikka perustuu menetelmiä tunnistaa tarkasti määritelty osuus ihmisen DNA: ta.

suoraa menetelmää

Suorat menetelmät DNA-diagnoosi ovat, kun syyllinen geeni perinnöllinen sairaus tunnetaan, kuten hyvin tiedetään, ja tyyppejä sen mutaatioita. Esimerkiksi, sopiva suora menetelmiä useita sairauksia. Tämä Huntingtonin tauti (extension CTG-toistoja), fenyyliketonuria (R408W), Mukoviskidoosia (delF508, suuret mutaatiot) ja vastaavat. Tärkein etu suora menetelmä on kokonaan omistama diagnostinen tarkkuus, ja ei ole tarvetta tehdä DNA-analyysi muun perheen. Jos mutaatio vastaavan geenin on todettu, se sallii tarkalleen hyväksyä diagnoosin perinnöllisyys, genotyypin määritys muun rasittavat perheen.

Toinen etu suoran diagnoosi pidetään tunnistamaan heterotsygoottista kantavan huono mutaatioiden sukulaisten ja vanhemmat, jotka kuolivat tautiin. Tämä pätee erityisesti sairauksien peittyvästi periytyvä. Haitat suorilla menetelmillä ovat myös saatavilla. Soveltaa niitä, sinun täytyy tietää tarkalleen paikallistaa epänormaali geenin eksoni-introni rakenne sen spektri ja sen mutaatioita. Ei kaikki monogeeniset sairaudet tänään saanut tällaista tietoa. Informatiivisuustaso suora menetelmiä ei voida pitää täydellisenä, koska yksi ja sama geeni voi olla suuri määrä patologisia mutaatio, joka aiheuttaa perinnöllisiä sairauksia.

epäsuoriin menetelmiin

Epäsuoria menetelmiä DNA-diagnostiikan käytetään kaikissa muissa tapauksissa, jos vahingoittunut geeni ei ole tunnistettu, mutta vain kromosomaalisesti, tai jos linja diagnoosi ei anna tulosta (se tapahtuu, mikäli geeni monimutkainen molekyyli- organisaatio tai suuressa määrin, jos on paljon patologinen mutaatioita). Epäsuorien menetelmien suoritetaan erottelu analyysi polymorfisten markkerien alleeliset perheessä. Löydettyjä markkereita samassa kromosomissa samalla alueella tai lokuksen liittyy läheisesti taudin ja edustavat deleetioita tai insertioita, kohta substituutioita, toistoja, ja niiden polymorfismi johtuu eri solujen määrä lohkossa.

Mukavin epäsuoran diagnoosi pitää mikrosatelliitti ja minisatelliitti polymorfismeja, jotka ovat levinneet laajalti ihmisen genomista. niiden arvo ilmaistaan tieto- sisältö on suuri, jos vaurioita geneettinen etäisyys markkerin ja geeni ei ole liian suuri. Jälkimmäisessä tapauksessa, arviointitarkkuutta riippuu pitkälti taajuuden välisen rekombinaation polymorfisen markkerin ja vaurioita. Epäsuora diagnostisia menetelmiä myös pakollista esivaiheen alleelifrekvenssien analysoitavasta populaatiosta tutkimus potilailla, ja kantavat mutaatioita, sekä määrityksen tarpeellisuuden todennäköisyys rekombinaation nonequilibrium ja tarttuvuus markkereita ja mutanttialleelit.

muita menetelmiä

Lyhyt segmenttejä RNA: ta tai DNA: ta, sekä yhden geenin visualisoitiin mikroskooppinen tutkimus ei voi olla siksi, mutaatioiden tunnistamiseksi tarvitaan molekyyligenetiikan diagnoosin. On "Human Genome Project", sekä muita edistysaskeleet molekyyligenetiikan huomattavasti laajennettu mahdollisuus diagnoosin perinnöllisiä sairauksia - sekä ennen synnytyksen jälkeinen. Nämä menetelmät voivat antaa varhaisen havaitsemisen ja tehdä ennuste poly- ja geeniin sairauksia, joiden debyytti tapahtuu aikuisiässä. Valitettavasti, koska tekniset valmiudet molekyyligeneettisten tutkimukset ovat toisinaan yli eettisiä rajoja, jotka on asetettu suhteessa perintö, varsinkin kun diagnoosi on murrosiässä ja lapsuuden.

Rakenne- ja numeeriset kromosomipoikkeavuuksien ovat yleisimpiä syitä taudin ja syövän, ja monet epämuodostumia. Kromosomivirheitä on tunnistettava, mikä on tärkeää perheneuvonta - arvioimaan ennusteen sekä lisääntymis- riskiä tulevaisuudessa raskauksissa. Kromosomi analyysi on "kultainen standardi" geneettinen diagnoosi, mutta se on rajoitettu. Vain menetelmät molekyyli- geneettinen analyysi voi tehdä enemmän, koska käytetään kloonauksen tekniikka perustuu fluoresoivat leimat, jotka kykenevät niiden suuri herkkyys tunnistaa hienovaraisia kromosomaalisten muutosten, joita ei voida havaita klassisen sytogeneettisen tutkimuksia. Nämä tekniikat ovat yhä laajentamalla diagnostiikkaominaisuuksien tarkasteltuna, lasten kehitysvammaisille, kehitysvammaisuus, monien muiden perinnöllisiä sairauksia.

tulokset

On erittäin tärkeää, ihmiskunnan olivat geenin rakenne ja toiminta tiedon, eri vaihtelua, kyky havaita perinnöllisiä sairauksia, joita esiintyi kehittämisen yhteydessä molekyyligenetiikan. sen menetelmät on suunnattu tutkimus DNA-molekyylin - ja kun se on normaalia, ja kun se on vaurioitunut. Valmistamiseksi deoksiribonukleiinihappo nukleotidien sekvenssit (DNA) ulottuu vaiheittain vastaanottamiseksi näytteiden tunnistaa yksittäisiä fragmentteja. Genomisen DNA: n soluista, rajoitus (repiminen), monistus (kloonaus), elektroforeesi fragmenttien (erottaa niiden sähkövarauksen ja molekyyli- painon agaroosigeelillä). Tunnistaminen spesifisiä fragmentteja sijaitsee pinnalla erillinen raita.

Sitten päästä teko suodattimia, joiden läpi kulkee kunkin fragmentin hybridisaatiolla kloonattujen DNA-fragmenttien tai synteettisten radioaktiivinen koettimien on ohjaus, joka on yhtä suuri kuin kunkin näytteen. Jos muuttaa asemaa tai pituus verrattuna koettimen, jos uusi fragmentti tai kadonnut - kaikki tämä viittaa siihen, että analysoitu geeni on tehty uudistamisesta nukleotidisekvenssissä. On kahdeksan perustavanlaatuisia molekyyli- geneettiset tutkimukset: sekvensointi (määritys DNA-sekvenssin), polymeraasiketjureaktio (määrän kasvu sekvenssejä), valmistamiseksi, alukkeiden tunnettujen geenien, DNA-kloonaus, rekombinanttien molekyylien saatuja proteiineja, koska yhdistelmä-DNA-molekyylejä, luodaan täydellinen (kokoelma kirjasto) kloonattujen fragmenttien, jotka saatiin käyttämällä rajoitus.